Application of TRIS Buffer in Plasmid Extraction by Agarose Electrophoresis

Tris (trihydroxymethylaminomethane) is een zwakke base met een pKa van 8,1 bij kamertemperatuur 25°C en een effectief bufferbereik van pH 7,0 ~ 9.2De pH van de waterige oplossing van Tris alkali is ongeveer 10.5. Zoutzuur wordt gewoonlijk toegevoegd om de pH-waarde aan te passen aan de gewenste waarde, zodat de buffer van deze pH-waarde kan worden verkregen.Het DNA wordt in een dergelijke oplossing ontprotoneerd., waardoor de oplosbaarheid wordt verbeterd. Wanneer de pH-gecorrigeerde zuuroplossing wordt vervangen door azijnzuur, wordt een "TAE-buffer" (Tris/acetaat/EDTA) verkregen,terwijl een "TBE-buffer" (Tris/Borat/EDTA) wordt verkregen door het te vervangen door boorzuurDeze twee buffers worden gewoonlijk gebruikt in nucleïnezuur-elektroforese-experimenten. TAE, TBE, enz. die door Tris worden bereid, zijn de meest gebruikte reagentia voor DNA-elektroforese, en TE (pH 8.0) wordt hoofdzakelijk gebruikt om DNA op te lossen.(TE is een combinatie van Tris en EDTA.)1MTris-HCl6.8 en 1.5MTris-HCl8.8 zijn de meest gebruikte reagentia voor SDS-PAGE.

TRIS-reagens

Onder de conventionele werkzaamheden van de genetische techniek is agarose-gel-elektroforese de meest gebruikte.identificatie en zuivering van DNA-fragmenten.Het gebruikt meestal een horizontaal elektroforese-apparaat om te elektroforese onder een elektrisch veld met constante intensiteit en richting.DNA-moleculen zijn negatief geladen in gelbuffers (meestal alkalisch) en migreren van negatieve naar positieve elektroden in een elektrisch veld.De snelheid van de DNA-molecuulmigratie is afhankelijk van de grootte en conformatie van het molecuul.De invloed van de kracht en richting van het elektrisch veld, de basissamenstelling, de temperatuur en de ingebedde kleurstoffen,enz..

Operatieproces:

1 TE buffer: (10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA)

Buffer voor elektroforese (50XTAE)

2 Buffer voor elektroforese (50XTAE): Tris 242g, glaciaal azijnzuur 57,1 ml, EDTA (0,5 mol/l pH 8,0) 100 ml

Verdun 50 keer met gedistilleerd water bij gebruik.

3 Proefbuffer (6X): 0,25% bromophenolblauw, 0,25% xyleenblauw, 40% (W/V) sacharose

4 STET buffer (pH 8,0) (8% saccharose, 0,5% Triton, 50 mmol/l EDTA, 10 mmol/l Tris)

1) 100 ml TAE-elektroforeseoplossing meten, 0,7 g agarose toevoegen, goed mengen, in de magnetron plaatsen, 3 minuten opwarmen, agarose volledig oplossen.

2) Sluit de schone en droge elektroforetische plaat met gesteriliseerd rubber en verzegel de rand met een kleine hoeveelheid agaroseoplossing.Plaats de kam en pas de afstand tussen de onderkant van de kam en de elektroforese plaat, is in het algemeen 1-2 mm geschikt.

3) Wanneer de opgeloste agarose-oplossing tot ongeveer 50 °C is afgekoeld, wordt 5 M L ethidiumbromide toegevoegd en is de eindconcentratie ethidiumbromide 1,0 m g/m L.Giet de agaroseoplossing in de elektroforeseplaat en houd deze stil zonder te bewegen.

4) Nadat de gel volledig is verstevigd (30-45 minuten bij kamertemperatuur), verwijdert u voorzichtig het kam, verwijdert u de tape en plaatst u de gel in het elektroforese pad.

5) In het elektroforeseproces werd een elektroforeseoplossing (1'TAE) toegevoegd om het agarosegeloppervlak te bedekken met ongeveer 1-2 mm elektroforeseoplossing.