Potentiële interferentie en copingstrategieën van HEPES op de kleurontwikkeling van fenolrood indicator

In celcultuur en biologische experimenten,HEPES-bufferDe eerste wordt gebruikt om de pH-stabiliteit in het kweekmedium te handhaven, terwijl de tweede wordt gebruikt om pH-veranderingen visueel weer te geven.de wisselwerking tussen de twee in termen van chemische eigenschappen kan leiden tot kleur afwijkingenDit artikel zal de oorzaken van dit fenomeen analyseren en vereenvoudigde optimalisatieoplossingen bieden.

Chemische basis van kleurinterferentie

Fenolrood is een pH-gevoelige kleurstof die van kleur verandert met zuurgraad of alkaliteit: het verschijnt geel in zure omgevingen (pH < 6,8), rood in neutrale omgevingen (pH ≈ 7,4),en paarsrood in alkalische omgevingen (pH> 8.2) Deze eigenschap maakt het een ideaal hulpmiddel voor de controle van de pH van celcultuurmedium.

De kernfunctie van HEPES als buffer is het stabiliseren van de pH door waterstofionen vrij te geven of te absorberen.Het probleem is dat de sulfozuren in HEPES moleculen een gelijkaardige chemische structuur hebben als fenolrood, en wanneer de concentratie HEPES hoog is, zullen ze met fenolrood reageren om de moleculaire structuur te veranderen.Deze verandering zorgt ervoor dat de kleur van fenolrood lichter wordt of verschuift bij een specifieke pHBij pH 7 kan het bijvoorbeeld oranje rood verschijnen in plaats van standaardrood.4.

De intuïtieve manifestatie van interferentie verschijnselen

Bij conventionele celcultuur kan de kleur van het kweekmedium lichter of geelachtig zijn dan verwacht, indien tegelijkertijd hoge concentraties HEPES (zoals meer dan 20 mmol/l) en fenolrood worden gebruikt..Bijvoorbeeld, het pH 7,4-cultuurmedium, dat rood had moeten worden weergegeven, is mogelijk lichtoranje geworden als gevolg van HEPES-interferentie, waardoor onderzoekers de pH-waarde verkeerd hebben beoordeeld.

In fluorescentiemicroscopie is deze interferentie meer uitgesproken.resulterend in een verminderde beeldhelderheid of verhoogd achtergrondgeluidDit effect is vooral opvallend bij langetermijnobservaties of experimenten met beeldvorming van levende cellen, die de ware toestand van cellen kunnen maskeren.

Vergemakkelijkt optimalisatieplan

HEPES-concentratie aanpassen

1. Conventionele teelt: controleer de concentratie van HEPES binnen 10-15 mmol/L, wat minimale interferentie heeft met de kleurontwikkeling van fenolrood en de pH-stabiliteit effectief kan handhaven.

2Kortetermijnproef: indien de proeftijd kort is (bijvoorbeeld < 4 uur), kan de concentratie van HEPES verder worden verlaagd tot 5 mmol/l, of alleen worden toegevoegd indien nodig.

3Gevoelige cellen: Voor cellen die extreem gevoelig zijn voor pH-veranderingen (zoals neuronen), wordt aanbevolen om bicarbonaat buffer systeem te gebruiken in plaats van HEPES of volledig verwijderen fenol rood.

Alternatieve kleurenweergave methoden

1Voor experimenten waarbij hoge concentraties HEPES nodig zijn, kan een kweekmedium zonder fenolrood worden geselecteerd.en pH-teststrips of elektronische pH-meters kunnen worden gebruikt om de zuurgraad en het alkalisch gehalte te controleren.

2. Fluorescerende sondes: met behulp van fluorescerende kleurstoffen zoals BCECF-AM in plaats van fenolrood worden deze sondes niet beïnvloed door HEPES-interferentie en kunnen ze nauwkeurigere pH-metingen leveren.

3. Kleurcorrectie: indien HEPES en fenolrood gelijktijdig moeten worden gebruikt, kan vooraf een standaardcurve worden voorbereid om de waargenomen kleurdeviatie door middel van een colorimetrische methode te corrigeren.

Optimalisatie van experimenteel ontwerp

1- Buffering in fasen: gebruik HEPES om de pH tijdens de precultuurfase van cellen te handhaven en schakel voor de beeldvorming over op een cultuurmedium zonder HEPES om de interferentie te verminderen.

2. Waallengte selectie: bij fluorescentiebeeldvorming,Vermijd de belangrijkste absorptiegolflengte van fenolrood (zoals 560 nm) en kies voor een langer golflengte fluorescentie kanaal (zoals 633 nm) om achtergrondinterferentie te verminderen.

3Controlegroep: Voor elk experiment werd een controlegroep zonder HEPES ingesteld om de kleurverschillen visueel te vergelijken.

Door het mechanisme van interactie tussen HEPES en fenolrood te begrijpen,Onderzoekers kunnen de experimentele omstandigheden gemakkelijk aanpassen om de betrouwbaarheid van de resultaten van de kleurontwikkeling te garanderen en tegelijkertijd de stabiliteit van het cultuurstelsel te behoudenVoor complexe experimenten wordt aanbevolen om eerst kleinschalige pre-experimenten uit te voeren om de doeltreffendheid van het optimaliseringsschema te verifiëren.

Hubei Xindesheng Material Technology is gespecialiseerd in de productie van HEPES en anderebiologische bufferactiesDe producten hebben een hoge zuiverheid, een goede buffercapaciteit en betaalbare prijzen, die productondersteuning bieden voor gerelateerde experimenten.Neem gerust contact met me op.!